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Mar 12, 2024

Pfirsichextrakt löst in einem experimentellen Nahrungsmittelallergiemodell systemische und lokale Immunreaktionen aus

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1892 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Pfirsichallergie gehört zu den häufigsten Nahrungsmittelallergien im Mittelmeerraum und löst bei Patienten häufig schwere anaphylaktische Reaktionen aus. Aufgrund des Risikos schwerwiegender Symptome sind Studien am Menschen begrenzt, was zu einem Mangel an therapeutischen Optionen führt. Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines Pfirsichallergie-Mausmodells als Werkzeug zum besseren Verständnis des Pathomechanismus und zur Ermöglichung präklinischer Untersuchungen zur Entwicklung optimierter Strategien für die Immuntherapie. CBA/J-Mäuse wurden intraperitoneal mit Pfirsichextrakt oder PBS unter Verwendung von Alaun als Adjuvans sensibilisiert. Anschließend wurde der Extrakt intragastrisch verabreicht, um den Darmtrakt einzubeziehen. Die Allergenprovokation erfolgte durch intraperitoneale Injektion des Extrakts, wobei der Abfall der Körpertemperatur als Hauptindikator für die Anaphylaxie gemessen wurde. Das Modell löste bei Mäusen allergiebedingte Symptome aus, darunter eine Senkung der Körpertemperatur. Die Antikörperspiegel in Serum und Darmhomogenaten zeigten eine Th2-Reaktion mit erhöhten Spiegeln von mMCPT-1, Pfirsich- und Pru-p-3-spezifischem IgE, IgG1 und IgG2a sowie erhöhten Spiegeln von IL-4 und IL-13. Die FACS-Analyse der Lamina propria des Dünndarms ergab erhöhte Mengen an T-Zellen, Neutrophilen und DCs bei Mäusen mit Pfirsichallergie. Diese Daten deuten auf die erfolgreiche Etablierung eines Pfirsichallergie-Mausmodells hin, das sowohl systemische als auch lokale gastrointestinale Reaktionen hervorruft.

Die häufigsten Auslöser von Nahrungsmittelallergien (FAs) bei Erwachsenen sind allergene Pflanzen wie Erdnüsse, Weizen, Früchte, Nüsse und Sojabohnen sowie unter anderem Eier, Milch und Fisch1,2,3. Insbesondere Lebensmittel aus der Familie der Rosacea, darunter Äpfel und/oder Pfirsiche, sind häufig an allergischen Reaktionen auf pflanzliche Lebensmittel beteiligt4. Vor allem im Mittelmeerraum, aber auch in Nord- und Mitteleuropa gehören unspezifische Lipidtransferproteine ​​(nsLTPs) zu den wichtigsten Pflanzenallergenen und werden mit schweren allergischen Symptomen in Verbindung gebracht5,6. nsLTPs sind kleine, hitzestabile und strukturell hochkonservierte Proteine6,7,8. Die Sensibilisierung gegenüber nsLTPs wird durch das Hauptallergen Pru p 3 des Pfirsichs dominiert, wobei Pfirsich als primärer Sensibilisator für nsLTP-bedingte klinische Kreuzreaktivität im Mittelmeerraum angesehen wird6,9. Die höchste Menge an Pru p 3 ist in der Pfirsichschale zu finden, mit einem Gehalt, der siebenmal höher ist als im Fruchtfleisch10,11. Dementsprechend wird die Pfirsichallergie selbst als häufige Ursache einer Frischobstallergie beschrieben10.

Derzeit sind die Hauptbehandlungsoptionen für Pfirsichallergien und Nahrungsmittelallergien im Allgemeinen die Vermeidung von Allergenen oder eine symptomatische Behandlung einschließlich Antihistaminika, da bisher keine Heilung oder vorbeugende Behandlung verfügbar ist12,13,14. Aufgrund dieses Mangels an Behandlungsmöglichkeiten könnte die orale Immuntherapie (OIT) als attraktive Option zur Induktion einer immunologischen Toleranz durch Verabreichung steigender Allergendosen angesehen werden. Die derzeit verfügbaren Daten zur OIT bei Pfirsichallergien reichen jedoch nicht aus, um Patienten in der klinischen Praxis eine OIT zu empfehlen15. Dies zeigt, dass dringend weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die verschiedenen Arten von FAs zugrunde liegen, und um daraus mögliche neue Therapien zu entwickeln. Daher werden Mausmodelle häufig zur Nachahmung und Untersuchung von FAs verwendet, die mit verschiedenen Allergenen wie Erdnüssen16, Kuhmilch17 oder Baumnüssen18 assoziiert sind. Diese ermöglichen die Untersuchung von Immunreaktionen und allergischen Pathologien, ohne die Gesundheit von Allergikern zu gefährden. Im Fall einer Pfirsichallergie entwickelten Rodriguez et al. ein Pru p 3-Allergie-Mausmodell, das eine intranasale Sensibilisierung von Pru p 3 in Kombination mit LPS und intraperitonealer Belastung nutzte, um Pru p 3-Allergie-bedingte Symptome hervorzurufen19. Dieses Modell stellt ein gutes Werkzeug für die Untersuchung der Mechanismen einer Pfirsichallergie dar und löst starke klinische Symptome wie eine Senkung der Körpertemperatur nach einer Provokation aus. Es konzentriert sich jedoch auf ein einzelnes Allergen und löst keine lokalen intestinalen Immunantworten aus, da der Darm nicht am Sensibilisierungsprozess beteiligt war.

In dieser Studie wollten wir ein Mausmodell für eine schwere Pfirsichallergie entwickeln, das nicht nur systemische, sondern auch lokale Darmreaktionen umfasst, die für FA charakteristisch sind. Die allergische Reaktion nach der Provokation wurde mittels In-vivo- und In-vitro-Analyse charakterisiert, wobei sowohl die humorale als auch die lokale Immunantwort des Gastrointestinaltrakts (GIT) berücksichtigt wurden.

Reife Pfirsiche (Sorte Royal Summer®) wurden in einem Lebensmittelgeschäft gekauft. Frisch zubereitete Schalen wurden sofort in Aceton und Trockeneis eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Die gefrorene Schale wurde zu Pulver gemahlen und anschließend lyophilisiert. Im Folgenden wurde 1 g getrocknetes Pfirsichschalenpulver mit 10 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (0,05 M), der 2 % Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10 mM Natriumdiethyldithiocarbamat (DIECA) enthielt, bei einem pH-Wert gemischt 8.3 nach der Methode von Björkstén et al.20 mit geringfügigen Modifikationen. Nach 2-stündiger Inkubation bei 4 °C unter kontinuierlichem Schütteln wurde CaCl2 bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Extrakt wurde 30 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert, der Überstand wurde mit einem 0,45-µm-Filter filtriert, gegen destilliertes H2O (dH2O) dialysiert und lyophilisiert. Der lyophilisierte Pfirsichschalenextrakt (PE) wurde in einem Mindestvolumen dH2O rekonstituiert und die Proteinkonzentration wurde mithilfe des Bradford-Proteinassays21 bestimmt. Unsere Studie entsprach den Richtlinien der IUCN Policy Statement on Research Involving Species at Risk of Extinction und dem Übereinkommen über den Handel mit gefährdeten Arten freilebender Tiere und Pflanzen. Da die in der Studie verwendeten Pfirsiche im örtlichen Lebensmittelgeschäft gekauft und für den menschlichen Verzehr vermarktet wurden, bestand kein Risiko für eine gefährdete Art oder eine genetische Veränderung.

Weibliche CBA/J-Mäuse wurden von der Charles River Deutschland GmbH gekauft und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung des Paul-Ehrlich-Instituts mit freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten. Mäuse wurden mit einer herkömmlichen AIN93G-Diät gefüttert. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt und die Protokolle und Studien wurden vom deutschen Tierschutzgesetz überprüft und genehmigt (Bewilligungsbehörde: RP Darmstadt, Deutschland, Genehmigungsnummer: F107/2005). Alle Mäuse waren zu Beginn des Experiments 6–8 Wochen alt und wurden zufällig den Versuchsgruppen zugeteilt. Wir bestätigen, dass alle Methoden der Studie in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und -Vorschriften durchgeführt und berichtet wurden.

Die Mäuse wurden intraperitoneal (ip) mit 200 µg PE-Protein (in 200 µl; n = 5) oder PBS (200 µl; n = 3) am Tag 0, Tag 7 und Tag 12 sensibilisiert. Imject™ Alum (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland) wurde als Adjuvans verwendet (1 mg pro Maus). Ab dem 19. Tag wurden die Tiere insgesamt dreimal jeden zweiten Tag 500 µg PE-Protein oder PBS per Schlundsonde (ig) ausgesetzt (in 200 µl). Die letzte Provokation erfolgte drei Tage nach der letzten Exposition durch ip-Injektion von 100 µg PE-Protein (in 200 µl) oder PBS. Die Körperkerntemperatur und der Symptomwert (Tabelle S1) wurden bis zu 30 Minuten nach jeder oralen Exposition und Provokation überwacht. Nach der Euthanasie mit CO2 wurden Milz und Darm zur späteren Verwendung gesammelt. Die gesammelten Seren und Darmproben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Aus dem Jejunum wurde Darmgewebe (10 cm Länge) entnommen, Peyer-Plaques entfernt und das Gewebe mit kaltem PBS gewaschen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das gefrorene Gewebe wurde mit Mörser und Stempel zerkleinert und das erhaltene Pulver in 300 µl kaltem PBS mit 1x Proteaseinhibitor (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) resuspendiert. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand in frische Röhrchen überführt. Die Proteinkonzentration wurde mittels BCA-Assay (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland) bestimmt und auf 5 mg/ml eingestellt.

Es wurden Milzen entnommen und Splenozyten durch manuelles Aufbrechen isoliert. Die Zellen wurden mit 105 Zellen/Well in eine 96-Well-Rundbodenplatte ausgesät und mit 10 ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 1 µM Ionomycin 72 Stunden lang stimuliert. Der Überstand wurde gesammelt und die Zytokinspiegel mittels ELISA bestimmt. Kurz gesagt, 50 µl gereinigter IL-5-Fängerantikörper (Klon: TRFK5; eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland) oder IFNγ-Fängerantikörper (Klon: XMG1.2; eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland) wurden im Coating auf Mikrotiterplatten aufgetragen Puffer (50 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9,6) über Nacht bei 4 °C. Nach der Blockierung mit 10 % FCS in PBS für 2 Stunden bei RT wurden 50 µl der Probe doppelt zugegeben (Verdünnung 1:10 für IFNγ und unverdünnt für IL-5) und 2 Stunden bei RT inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten 1 Stunde lang mit 50 µl biotinyliertem Anti-IFNγ-Nachweisantikörper (Klon: R4-6A2; eBioscience; 1:1000) oder Anti-IL-5 (Klon: TRFK4; eBioscience; 1:1000) inkubiert RT. Anschließend wurden 50 µl Meerrettichperoxidase (HRP)-markierte Streptavidinlösung (BD Pharmingen; 1:2000) zugegeben und 30 min bei RT inkubiert. Zytokine wurden durch Zugabe von 100 µl TMB-Substrat (0,525 mM 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, 0,01 % H2O2 in 0,21 M Kaliumcitratpuffer; pH 3,95) durch Messung der Absorption bei 450 nm nachgewiesen. IL-4 (R&D Systems) und IL-13 (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland) wurden durch ELISA mit kommerziellen Reagenzienkits gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Zur Bestimmung antigenspezifischer Antikörper wurden 50 µl natürliches Pru p 3 (nPru p 3; gereinigt aus Pfirsichschalen wie zuvor beschrieben22) oder PE über Nacht auf Mikrotiterplatten aufgetragen (5 bzw. 50 µg/ml; in Beschichtungspuffer). bei 4 °C. Nach der Blockierung mit 10 % FCS in PBS für 2 Stunden bei RT wurden 50 µl Serum oder Darmhomogenate für 2 Stunden bei RT inkubiert. Biotinylierter Anti-Maus-IgE-Antikörper (R35-118; BD Biosciences; 1:1000) wurde 1 Stunde lang bei RT inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation von HRP-markiertem Streptavidin. Zum Nachweis von Antigen-spezifischem IgG1 (sIgG1) und sIgG2a wurden HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG1 (Thermo Fisher Scientific; 1:2000) oder Kaninchen-Anti-Maus-IgG2a (Thermo Fisher Scientific; 1:2000) verwendet. Antigenspezifische Antikörper wurden durch Zugabe von TMB-Substrat und anschließende Messung der Absorption bei 450 nm nachgewiesen. Der Nachweis von Gesamt-IgE, Gesamt-IgG, Gesamt-IgA sowie mMCPT-1 erfolgte mit kommerziellen ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland).

Die Dissoziation der Lamina propria wurde nach einem angepassten Protokoll von Weigmann et al.23 durchgeführt. Kurz gesagt, der Dünndarm wurde entnommen, Fettgewebe und Peyer-Plaques entfernt. Die Därme wurden mit kaltem PBS gewaschen, der Länge nach geöffnet und in 1 cm große Stücke geschnitten. Die Proben wurden weiter in 1 × Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 5 mM Dithiothreitol (DTT), bei 37 °C 20 Minuten lang gewaschen. Anschließend wurden die Darmstücke durch ein 100-µm-Zellsieb gegeben und in Vorverdauungslösung (1 × HBSS mit 5 mM EDTA und 10 mM HEPES) 20 Minuten lang bei 37 °C unter langsamer Rotation inkubiert. Die Proben wurden erneut durch ein 100-µm-Zellsieb gegeben und anschließend wiederholt in Voraufschlusslösung inkubiert. Anschließend wurden die Darmstücke mit 1× HBSS mit 10 mM HEPES gewaschen, durch ein Zellsieb passiert und in Verdauungslösung (0,5 mg/ml Kollagenase D; 0,5 mg/ml DNase I; 1 mg/ml Dispase II in PBS) inkubiert. für 20 Minuten bei 37 °C unter langsamer Rotation. Anschließend wurden die Proben durch ein 40-µm-Zellsieb geleitet und der Durchfluss in kaltem FCS gesammelt. Die isolierten Zellen wurden wiederholt in kaltem PBS gewaschen, gezählt und für die weitere Analyse mittels FACS verwendet.

Einzelzellsuspensionen von Lamina propria-Zellen wurden einer Fc-Blockierung mit Anti-CD16/32 (Klon: 93; eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland) unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit extrazellulären Antikörpern (Tabelle S2) und Lebensfähigkeitsfarbstoff (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland). ) und ggf. Kernfärbung (true-nuclear, BioLegend). Informationen zu Antikörpern, Färbepanels und Gating-Strategien finden Sie in Tabelle S2 und Abbildungen. S1 bzw. S2. Die Daten wurden mit FACS Symphony (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) erfasst und über FlowJo (Version 10.0.8r1; BD Biosciences) analysiert.

Proteine ​​von PE und nPru p 3 (10 µg/Spur; Länge: 0,5 cm; Dicke: 1,5 mm) wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 16 % Acrylamidgel24 aufgetrennt und mit GelCode Blue Stain Reagent sichtbar gemacht (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland). Für den Inhibitionsblot wurden nPru p 3 und/oder PE einer SDS-PAGE (50 ng/cm; Länge der Länge: 1,2 cm; Dicke: 1,0 mm) unter nicht reduzierenden Bedingungen unterzogen und durch halbtrockenes Blotting auf eine Nitrozellulosemembran übertragen25 , gefolgt von Blockierung mit TBS-Puffer, der 0,3 % Tween 20 enthielt. Die Membran wurde mit Pru av 3-reaktivem (Cherry nsLTP) Kaninchenserum (CE-Immundiagnostika) inkubiert und BSA oder nPru p 3 wurden in abnehmenden Konzentrationen (1, 0,1 und) zugegeben 0,01 µg/ml). Als Kontrolle wurde nicht reaktives Kaninchen-Präimmunserum verwendet. Zum Nachweis von gebundenem IgG wurden HRP-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Cell Signaling) und verstärkte Chemilumineszenz (ECL) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) verwendet. Um die Reaktivität von Mäuseserum zu untersuchen, wurden nPru p 3 und/oder PE einer SDS-PAGE (10 µg/cm; Länge: 1,2 cm; Dicke: 1,0 mm) unter nicht reduzierenden Bedingungen unterzogen und per Semi auf eine Nitrozellulosemembran übertragen - Trockenblotting25, gefolgt von Blockierung mit TBS-Puffer, der 0,3 % Tween 20 enthält. Die Membran wurde mit Serumpools von Mäusen inkubiert, die mit PE oder PBS behandelt wurden (Basis- und Endzeitpunkte; 1:1000 verdünnt in TBS mit 0,05 % Tween und 0,1 % BSA) für 2 Stunden bei RT. Nach dem Waschen wurde AP-markierter Ratten-Anti-Maus-IgG1-Antikörper (BD Pharmingen; 1:1000) 1,5 Stunden lang bei RT inkubiert. Um gebundenes IgG nachzuweisen, wurde NBT/BCIP-Lösung zugegeben, bis die Proteinbanden sichtbar waren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von dH2O gestoppt.

Die Ergebnisse werden als kombinierte Daten aus zwei separaten Mausexperimenten angezeigt, die unter denselben experimentellen Einstellungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und die Daten wurden statistisch mittels Mann-Whitney-U-Test oder ANOVA (α = 0,05) ausgewertet. Die Statistiksoftware war Graph Pad Prism Version 9.2.0.

Vor der Entwicklung eines Pfirsichallergie-Mausmodells wurde PE hinsichtlich des Proteinmusters und der Antikörperreaktivität charakterisiert (Abb. 1). Das PE zeigte ein breites Spektrum an Proteinen mit einem Pru p 3-Gehalt, von dem angenommen werden konnte, dass er etwa 50 % der enthaltenen Proteine ​​ausmacht (Abb. 1a). Die Identität von Pru p 3 in PE wurde durch Immunoblot und Konkurrenztest unter Verwendung von nPru p 3 als Inhibitor bestätigt, was zeigte, dass das vorherrschende Protein im verwendeten PE Pru p 3 war (Abb. 1b).

Eigenschaften von Pfirsichschalenextrakt (PE). (a) Das Proteinmuster von Pfirsichschalenextrakt (PE) wurde mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung bestimmt, natürliches Pru p 3 (nPru p 3; P) wurde als Referenz verwendet; (b) nPru p 3 oder PE wurden einer SDS-PAGE und anschließender Immunoblot-Analyse unterzogen. Zur Bestimmung der Allergenreaktivität wurde nsLTP-reaktives Kaninchenserum verwendet und die Hemmung der Antikörperbindung mit steigenden Dosierungen von nPru p 3 oder BSA als Kontrolle durchgeführt. Negativkontrolle (N) oder sekundäre Antikörperkontrolle (S) wurden entweder mit Puffer oder nur mit sekundärem Antikörper inkubiert.

Zur Auslösung einer Pfirsichallergie wurde ein Mausmodell etabliert, das die systemische und gastrointestinale Exposition gegenüber Pfirsichproteinen umfasste. Mäuse wurden mit PE oder PBS mit Alaun als Adjuvans gemäß dem in Abb. 2a gezeigten Schema behandelt. Die Körperkerntemperatur wurde nach jeder oralen Exposition (Abb. S3) und nach der Provokation (Abb. 2b) überwacht. Die Provokation mit PE zeigte einen signifikanten Temperaturabfall von mehr als 2 °C, der in der Kontrollgruppe nicht beobachtet wurde (Abb. 2b,c). Da ein Temperaturabfall von mehr als 2 °C als humaner Endpunkt definiert wurde, wurden die Mäuse aus Tierschutzgründen getötet. Darüber hinaus entwickelten Mäuse, denen PE verabreicht wurde, allergiebedingte klinische Symptome, wie Verhaltensänderungen, Konsistenz des Stuhls und zerzaustes Fell (Abb. 2d; Tabelle S1), die im Vergleich zu PBS mit jeder oralen PE-Exposition allmählich zunahmen. behandelte Gruppe. Die höchste Punktzahl wurde jedoch erwartungsgemäß nach der letzten Provokation mit PE erreicht.

Induktion allergischer Anzeichen einer experimentellen Nahrungsmittelallergie im Mausmodell mit Pfirsichallergie. (a) Schematische Darstellung des verwendeten Modells. (b) Die Körpertemperatur wurde vor (-15 Min.; Basislinie) und bis zu 30 Min. nach der ip-Provokation gemessen. (c) Körpertemperatur einzelner Mäuse 15 Minuten nach der ip-Provokation und (d) Symptombewertung nach oraler Exposition in der dritten Woche und Provokation. n = 6–10, Daten dargestellt als Kombination von zwei Experimenten, die unter identischen Einstellungen durchgeführt wurden; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Zusätzlich zur Auslösung klinischer Symptome wurde die humorale Immunantwort der Mäuse untersucht. Daher wurden im Serum PE- und Pru p 3-spezifische Antikörper gemessen. Mit PE behandelte Mäuse entwickelten einen signifikanten Anstieg von PE-spezifischem IgE, IgG1 und IgG2a (Abb. 3a – c). Vergleichbare Ergebnisse wurden für Pru ​​p 3-spezifische Antikörper beobachtet (Abb. 3d – f). Das Verhältnis von PE- sowie Pru p 3-spezifischem IgG1 zu sIgG2a war in der PE-Gruppe nach der Provokation signifikant erhöht (Abb. 3g–h).

Pfirsichextrakt- und Pru p 3-spezifische Antikörperantwort im Serum. Die Konzentrationen an Pfirsichextrakt (PE)-spezifischem (a) IgE, (b) IgG1 und (c) IgG2a sowie Pru p 3-spezifischem (d) IgE, (e) IgG1 und (f) IgG2a wurden analysiert Serum der Mäuse vor (Basislinie) oder nach (endgültiger) Sensibilisierung und Provokation mittels ELISA. Das Verhältnis von (g) PE-spezifischem und (h) Pru p 3-spezifischem IgG1 zu IgG2a wurde für den Ausgangs- und Endzeitpunkt bestimmt. n = 6–10, Daten dargestellt als Kombination von zwei Experimenten, die unter identischen Einstellungen durchgeführt wurden; ***p < 0,001.

Im Einklang mit den erhöhten Konzentrationen spezifischer Antikörper wurde im Serum muriner Mastzellprotease-1 (mMCPT-1) bestimmt, was einen signifikanten Anstieg bei PE-behandelten Mäusen zeigte (Abb. 4a). Darüber hinaus wurde die Pru p 3- und PE-spezifische IgG-Immunantwort durch Immunoblot bestimmt (Abb. 4b). Nach der Provokation zeigten die PE-behandelten Mäuse eine Reaktivität hauptsächlich gegen nPru p 3, aber auch gegen andere, noch nicht identifizierte Proteine, die im PE enthalten waren.

mMCPT-1-Spiegel und IgG-Reaktivität im Serum. Die Konzentrationen von (a) mMCPT-1 wurden im Serum der Mäuse nach der (letzten) Provokation mittels ELISA analysiert. (b) Pfirsichextrakt (PE) und nPru p 3 (P) wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einer Immunblot-Analyse unter Verwendung von Serumpools aus den Versuchsgruppen vor (basal) oder nach der Provokation (endgültig). n = 6–10, Daten dargestellt als Kombination von zwei Experimenten, die unter identischen Einstellungen durchgeführt wurden; ***p < 0,001.

Darüber hinaus wurden die Gesamtkonzentrationen an Immunglobulin (Ig) gemessen. PE-behandelte Mäuse zeigten nach der Provokation signifikant erhöhte Gesamt-IgE- und IgG-Werte im Serum (Abb. S4a, b). Im Vergleich dazu waren die Gesamt-IgA-Titer bei Mäusen mit Pfirsichallergie nach der Provokation im Vergleich zu Kontrollmäusen und Ausgangswerten verringert (Abb. S4c). Die Zytokinsekretion nach Stimulation der Splenozyten zeigte nach der PE-Behandlung signifikant erhöhte Spiegel der Th2-Zytokine IL-4 und IL-13, wohingegen IL-5 und IFNγ unverändert blieben (Abb. S5a–d).

Um die FA-Reaktion in einem Mausmodell erfolgreich nachzuahmen, ist eine systemische Reaktion, aber auch die Beteiligung des Darmtrakts entscheidend. Hier zeigte die Behandlung mit PE eine Verlängerung sowohl des Dünn- als auch des Dickdarms (Abb. S6).

Die Analyse von Immunzellen aus der Lamina propria des Dünndarms mittels Durchflusszytometrie ergab die Induktion einer lokalen Immunantwort bei PE-behandelten Mäusen (Abb. 5a – i). Die Häufigkeit von B-Zellen blieb stabil, während die Häufigkeit von T-Zellen bei allergischen Mäusen erhöht war, was mit einem leichten Anstieg von CD8+ (CTLs) und einem starken Anstieg von CD4+ (Th-Zellen) und regulatorischen T-Zellen (Tregs) korrelierte. Auch die Häufigkeit von Neutrophilen und konventionellen dendritischen Zellen (cDCs) war bei den Pfirsich-allergischen Mäusen im Vergleich zu den PBS-Kontrollen deutlich erhöht. Eosinophile und Mastzellen waren bei den PE-behandelten Mäusen nicht erhöht, jedoch konnte eine lokale Aktivierung der Mastzellen im Darm durch signifikant erhöhte mMCPT-1-Spiegel im Überstand von Darmhomogenaten gezeigt werden, wenn Mäuse mit PE behandelt wurden (Abb. 6a). . Eine weitere histologische Analyse mittels H&E- und Giemsa-Färbung ergab eine geringe Anzahl an Neutrophilen und Eosinophilen in der Lamina propria beider Behandlungsgruppen und eine ähnliche Anzahl an Mastzellen in der Schleimhaut, Submukosa und Muskelschicht (Daten nicht gezeigt). Die Messung der lokalen Antikörperkonzentrationen in den Dünndarmhomogenaten ergab erhöhte Werte an Gesamt-IgE und IgG, jedoch nicht an IgA (Abb. 6b–d). Diese Ergebnisse deuten auf eine wesentliche Beteiligung des Darmsystems am Mausmodell mit Pfirsichallergie hin.

Immunologische Reaktionen im Dünndarm. Der Dünndarm wurde enzymatisch behandelt und isolierte Lamina propria-Immunzellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. (a) B-Zellen (CD45+ CD19+-Zellen), (b) T-Zellen (CD45+ CD3+-Zellen), (c) CTLs (CD45+ CD3+ CD8+-Zellen), (d) Th-Zellen (CD45+ CD3+ CD4+-Zellen), (e) Tregs ( CD45+ CD3+ CD4+ Foxp3+), (f) Mastzellen (CD45+ CD117+), (g) Eosinophile (CD45+ Siglec F+), (h) Neutrophile (CD45+ Ly6G+) und (i) cDCs (CD45+ CD11c+). n = 3–5; *p < 0,05; **p < 0,01.

Lokale humorale Reaktion und mMCPT-1 im Dünndarm. Die Konzentrationen von (a) mMCPT-1, (b) Gesamt-IgE, (c) Gesamt-IgG und (d) Gesamt-IgA wurden im Überstand von Darmhomogenaten mittels ELISA bestimmt. n = 6–10, Daten dargestellt als Kombination von zwei Experimenten, die unter identischen Einstellungen durchgeführt wurden; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Die Entwicklung einer IgE-vermittelten Allergie korreliert stark mit einer Fehlregulation der Th1- und Th2-Lymphozyten, wobei insbesondere Th2-Zellen als Schlüsselakteure sowohl für die Initiierung als auch für die Effektorphase einer allergischen Entzündungsreaktion betrachtet werden26. Insbesondere im Mittelmeerraum sind nsLTPs häufige Auslöser von FAs und die Sensibilisierung gegen Pfirsiche mit seinem Hauptallergen Pru p 3 ist weit verbreitet8,27.

In der vorliegenden Studie haben wir ein Pfirsichallergie-Mausmodell etabliert, um bessere Einblicke in immunologische Reaktionen auf die Entwicklung einer Pfirsichallergie, Mechanismen und zukünftige Bewertung von Interventionsstrategien, z. B. neuartige Therapiekandidaten, zu gewinnen. Im Gegensatz zu anaphylaktischen Reaktionen nach Kontakt mit Nahrungsmittelallergenen beim Menschen, die einen schnellen Blutdruckabfall sowie Haut-, Magen-Darm- oder Herz-Kreislauf-Symptome verursachen, sind bei Mäusen ein Abfall der Körperkerntemperatur oder allergischer Durchfall typische Parameter28,29. Mausmodelle ahmen menschliche Krankheiten künstlich nach und können die Pathologie menschlicher Zustände kaum vollständig widerspiegeln. In dieser Studie wurden CBA/J-Mäuse auf der Grundlage früherer Beobachtungen ausgewählt, dass LTPs als Sensibilisierungsmittel bei diesem Mäusestamm starke und Th2-abhängige Antigen-spezifische Antikörperreaktionen induzieren (Daten nicht gezeigt). Da die orale Sensibilisierung aufgrund der Induktion von Toleranz oder einer begrenzten IgE-Reaktion30 eine der größten Herausforderungen bei der Etablierung eines FA-Mausmodells darstellt, zeigen unsere Ergebnisse, dass die Kombination aus IP-Sensibilisierung, gefolgt von oraler Exposition und abschließender IP-Provokation mit PE erfolgreich war löst sowohl systemische als auch lokale allergische Reaktionen im Darm der Mäuse aus. Pru p 3- und PE-spezifische Antikörper, einschließlich sIgE, sIgG1 und sIgG2a, waren im Serum der allergischen Mäuse signifikant erhöht, wobei sIgG1 im Vergleich zu sIgG2a erhöht war, was auf die Induktion einer Th2-abhängigen Immunreaktion hindeutet31. Dies könnte durch erhöhte Spiegel der Th2-Zytokine IL-4 und IL-13, jedoch nicht des Th1-Zytokins IFNγ32, das von den Splenozyten PE-allergischer Mäuse produziert wird, weiter bestätigt werden. Dementsprechend waren die Gesamt-IgE-Spiegel, das entscheidende Immunglobulin, das an Typ-I-Allergiereaktionen beteiligt ist33, sowie die Gesamt-IgG-Spiegel im Serum und in den Darmhomogenaten der Mäuse mit Pfirsichallergie stark erhöht. Im Gegensatz dazu waren die Gesamt-IgA-Spiegel im Serum signifikant verringert, was mit Berichten über eine schützende Rolle von IgA bei allergischen Erkrankungen durch Hemmung der IgE-induzierten Mastzelldegranulation und Zytokinproduktion korreliert34,35.

Neben den systemischen Auswirkungen einer schweren allergischen Reaktion wurde die lokale intestinale Immunantwort als von größter Bedeutung für die erfolgreiche Etablierung eines FA-Modells angesehen. Eine erhöhte Anzahl von T-Zellen, insbesondere CD4+-Th-Zellen, stützt die Hypothese einer Th2-abhängigen Immunantwort. Th-Zellen könnten durch verstärkte cDCs induziert werden, die das Allergen aufnehmen und präsentieren, was zur Aktivierung naiver CD4+-Zellen und zur Differenzierung in Th2-Zellen führt36. Darüber hinaus wurde auch vermutet, dass die Induktion von CD8+-CTLs eine Rolle bei der Th2-Reaktion auf IgE-vermitteltes FA37 spielt. Überraschenderweise wurde bei PE-behandelten Mäusen eine Hochregulierung von Tregs beobachtet, von denen normalerweise bekannt ist, dass sie in Maus-FA-Modellen die Anaphylaxie unterdrücken, indem sie die Reaktionen von Effektor-T-Zellen steuern und dadurch Toleranz induzieren38,39. Allerdings können neben der allgemeinen Expression von Foxp3 und CD2540 bestimmte Subtypen von Treg unterschieden werden, die in dieser Studie nicht weiter charakterisiert wurden. Ebenso ist der Stoffwechselzustand der identifizierten Tregs unbekannt. Tregs können in ruhendem, aktiviertem oder funktionell erschöpftem Zustand vorliegen, abhängig von den Zell- und Umweltreizen, die ihre metabolische und immunologische Homöostase aktiv aufrechterhalten41. Zusammengenommen könnten die identifizierten Tregs eine andere Rolle spielen und möglicherweise nicht ausreichen, um allergische Entzündungen zu unterdrücken42. Obwohl die Anzahl der Mastzellen in der Lamina propria von PE-behandelten Tieren unverändert blieb, war der Aktivierungsstatus, gemessen als mMCPT-1-Spiegel, deutlich erhöht und kann als systemische Anzeige für die Aktivierung von Schleimhautmastzellen bei antigenspezifischer IgE-Kreuzung verwendet werden -Verknüpfung43,44. Darüber hinaus beobachteten wir keine erhöhte Anzahl von Eosinophilen in der Lamina propria, was mit vergleichbaren IL-5-Spiegeln zwischen der Allergiker- und der Kontrollgruppe korrelierte. Studien zeigten, dass IL-5- und Eosinophilen-assoziierte Entzündungen bei IgE-vermittelten FAs weniger offensichtlich sind, was die unveränderte Rekrutierung von Eosinophilen über IL-545 erklären könnte,46. Noch wichtiger ist, dass die beobachtete erhöhte Anzahl von Neutrophilen auf den Beginn entzündlicher Immunreaktionen im Darmtrakt der Mäuse mit Pfirsichallergie hinweist, die die Anziehung von DCs, T-Zellen, Monozyten und Makrophagen fördern47. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass das etablierte Pfirsichallergiemodell nicht nur systemische, sondern auch intestinale Immunantworten induziert.

Im Gegensatz zu einem zuvor veröffentlichten experimentellen Pru p 3-Allergiemodell19 verwendet das vorliegende Modell eine Kombination von aus der Pfirsichschale extrahierten Proteinen anstelle des gereinigten Allergens als Sensibilisierungs- und Provokationsmittel. In unserem Fall zeigte die Sensibilisierung mit einem hochgereinigten Allergen (nPru p 3) eine geringe Immunogenität und reichte nicht aus, um die Antikörperproduktion bei den Mäusen auszulösen, wie bei PE beobachtet (Abb. S7a). Um eine Sensibilisierung gegen gereinigtes Pru p 3 zu erreichen, sind möglicherweise zusätzliche Adjuvanseffekte erforderlich, wie von Rodriguez et al. vorgeschlagen. durch die Verwendung von LPS19.

Interessanterweise waren in unserer Studie die Werte von Pru p 3 sIgE vergleichbar, wenn die Mäuse mit PE/Alaun sensibilisiert und entweder mit PE oder nPru p 3 provoziert wurden (Abb. S7b). Allerdings waren die Gesamt-IgE- und IgG-Werte höher, wenn PE zur Sensibilisierung und Provokation eingesetzt wurde. Der Grund dafür könnte eine stärkere Sensibilisierungskapazität von PE im Vergleich zu Pru p 3 allein aufgrund der Exposition und Sensibilisierung gegenüber mehreren Allergenen sein. Wie durch Immunoblot beobachtet, reagierten Seren allergischer Mäuse gegen mehrere Proteine ​​im Extrakt. Im Hinblick auf das Molekulargewicht der nachgewiesenen reaktiven Proteine ​​könnte man spekulieren, dass Pru p 7 oder Pru ​​p 1 im Extrakt enthalten sein könnten, die sich beide hauptsächlich in Pfirsichschalen befinden und bei Allergikern zu schweren Symptomen führen48,49. Darüber hinaus könnten Pru p 3 und sein natürlicher Ligand als Komplex im Pfirsichextrakt vorliegen, was aufgrund der adjuvansähnlichen Wirkung des LTP-Liganden zu einer erhöhten Allergenität führt50. Darüber hinaus spekulieren wir über die Bedeutung unbekannter potenzieller wasserlöslicher Matrixkomponenten, die eine Adjuvanswirkung vermitteln. Matrixeffekte des PE, einschließlich Fetten, Kohlenhydraten oder anderen Proteinen unter den Allergenen, könnten die Allergenität verstärken, hauptsächlich durch Beeinflussung der Antigenverfügbarkeit und -verdaulichkeit, wodurch die Sensibilisierungskapazität der Pfirsichallergene erhöht wird51.

Präklinische Studien an entsprechenden Mausmodellen sind von besonderer Bedeutung für Allergene, die schwere und lebensbedrohliche Reaktionen hervorrufen können, wodurch klinische Studien weniger durchführbar sind. Somit kann dieses Modell nicht nur zur Untersuchung von Pfirsichallergien, sondern auch der Pru ​​p 3-Sensibilisierung verwendet werden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Andrea Wangorsch für die Reinigung von nPru p 3, das für die In-vitro-Analyse in dieser Studie verwendet wurde, und Dr. Domingo Barber für die hilfreiche Diskussion im Zusammenhang mit der LTP-Extraktion. Die vorliegende Studie wird teilweise gefördert durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), BMBF-ERA 01EA1901 und AC18/00031 (DIFAMEM) und ein IGF-Projekt der FEI, das über AiF (AiF20528) im Rahmen des Förderprogramms gefördert wird die Industrielle Gemeinschaftsforschung (IGF) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie (BMWi).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: M. Albrecht und F. Blanco-Pérez.

Molekulare Allergologie, Paul-Ehrlich-Institut (PEI), Bundesinstitut für Impfstoffe und biomedizinische Arzneimittel, Langen, Deutschland

H. Steigerwald, M. Krause, S. Vieths, S. Scheurer, M. Albrecht & F. Blanco-Pérez

Institut für Pathologie und Neuropathologie, Comprehensive Cancer Center, Universitätsklinikum Tübingen, Eberhard Karls Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

I. Gonzalez-Menendez & L. Quintanilla-Martinez

Exzellenzcluster iFIT (EXC 2180) „Image-Guided and Functionally Instructed Tumor Therapies“, Eberhard Karls Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

I. Gonzalez-Menendez & L. Quintanilla-Martinez

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SV und S.Sch. konzipierten und gestalteten die Studie und waren an der Analyse und Interpretation sowie der Manuskripterstellung beteiligt. HS, FB-P. und MK führten die Experimente, die Datenanalyse sowie HS und FB-P durch. hat den Artikel verfasst. S.Sch. half beim Verfassen und Überarbeiten des Artikels. IG-M. und LQ-M. histologische Daten erhalten und analysiert; MA war an der Datenanalyse und der endgültigen Überarbeitung des Manuskripts beteiligt. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit F. Blanco-Pérez.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen, außer dass Dr. Vieths persönliche Honorare von Schattauer (Allergologie Handbuch), persönliche Honorare von Elsevier (Nahrungsmittelallergien und Intoleranzen), persönliche Honorare von Karger (Food Allergy: Molecular Basis and Clinical Practice) und persönliche Honorare von Journal angibt of Allergy and Clinical Immunology (Associate Editor), außerhalb der eingereichten Arbeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Steigerwald, H., Krause, M., Gonzalez-Menendez, I. et al. Pfirsichextrakt löst in einem experimentellen Nahrungsmittelallergiemodell systemische und lokale Immunreaktionen aus. Sci Rep 13, 1892 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28933-1

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Eingegangen: 25. November 2022

Angenommen: 27. Januar 2023

Veröffentlicht: 02. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28933-1

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